【目的】

    1.复制急性中毒性肾功能不全的动物模型。

    2.观察升汞中毒兔的血尿素氮水平、尿的变化、肾脏形态的改变。

    3.根据实验指标，分析及讨论急性肾衰的病理生理变化及其发生机制。

 

【器材】电子计重器、离心机、分光光度计、水浴锅、显微镜、手术器械一套、10ml注射器若干、插管、试管、滴管、吸管、试管夹、酒精灯、离心管、玻片、试管架。

 

【药品】1%氯化高汞(HgCl₂)溶液、0.9%氯化钠溶液、20%乌拉坦、1%肝素生理盐水溶液、5%醋酸溶液、尿素氮标准贮存液、尿素氮标准应用液、二乙酰-肟-氨硫脲液(DAM-TSC)、酸混合液、蒸馏水。

 

【动物】家兔。

 

【观察指标】尿常规、尿蛋白、血浆尿素氮、肾重/体重、肾组织学检查；

 

【方法】

1.取家兔两只，一只作为正常对照，另一只作为中毒实验兔。于实验前一天，将实验兔皮下或肌肉注射1%HgCl₂ (1.5～1.7ml/kg，一次注射)，造成急性中毒性肾功能不全模型；对照兔则在相同部位注射同量的生理盐水，作为对照备用。

2.实验开始，家兔称重后腹腔注射20%乌拉坦（5ml/kg）麻醉，仰卧固定于兔台上，颈部、下腹部剪毛备皮。颈部正中切口，分离一侧颈总动脉，颈动脉插管内注入1%肝素生理盐水溶液，进行颈动脉插管。在耻骨联合上1.5cm处做正中切口长约4cm，分离皮下组织，沿腹白线切开腹膜，暴露膀胱，穿刺收集全部尿液，测定尿量，供尿蛋白定性检查和尿液镜检。

    3.尿蛋白定性检查：取正常及中毒兔尿液各约3m1分别放入试管中，以试管夹夹住试管，在酒精灯上加热至沸腾。若有混浊，加入5%醋酸3～5滴，再煮沸，若尿变清，是因醋酸可除去尿内磷酸盐或碳酸盐所形成的白色混浊所致；若混浊加重，则表示尿中含有蛋白，根据混浊程度可按下面标准判定结果：

    “﹣”表示尿液清晰不混浊

    “+”表示尿液出现轻度白色混浊(含蛋白质0.1～0.5g/L)

    “++”表示尿液呈现乳样混浊(含蛋白质0.5～2g/L)

    “+++”表示尿液混浊或有少量絮片存在(含蛋白质2～5g/L)

“++++”表示尿液出现絮状混浊(含蛋白质>5g/L)

     4.尿液镜检查

    (1)将收集的尿液直接滴于玻片上，或将尿液离心5min（1500 r/min）后取尿沉渣涂于玻片上，在显微镜下观察。低倍视野下观察管型，高倍视野下观察细胞，分别检查10个视野。

 5.血浆尿素氮测定：

(1)从正常及中毒家兔颈总动脉取血10ml，抗凝，离心20min (3000r/min)，分离血浆，用滴管将血清吸出，分别移入干燥的试管中备用。将试管分别标记后按表1操作，各试剂混匀后，立即置沸水锅中煮沸10min，置流水中冷却3min后比色。在520nm波长下比色，以空白管凋零，记录标准管及测定管的光密度值。

表1  血浆尿素氮测定

试剂（ml）	空白管	标准管	测定管A	测定管B
血清	——	——	0.02	0.02
水	0.5	0.1	0.5	0.5
尿素氮标准应用液	——	0.4	——	——
DAM-TSC液	0.5	0.5	0.5	0.5
酸混合液	4.0	4.0	4.0	4.0

【注·原理】血液和尿中的尿素在强酸条件下与二乙酰-肟-氨硫脲液煮沸，生成红色复合物(二嗪衍生物)。

(2)计算每100ml血清中尿素氮的含量(mg)

 

6.形态学观察

(1)将对照家兔与中毒家兔一并处死，取出肾脏，称重、测肾重与体重之比 (体重最好为去肠道体重)。观察并比较两只家兔的肾脏体积大小、皮质条纹及色泽等。

(2)组织切片示教：于显微镜下观察皮质肾小管上皮有无明显的变性、坏死、脱落；管腔内有无大量蛋白，以及红细胞和管型的存在。

 

【结果】将所观察的实验结果填入下表：

  表2      实验结果与分析

 

【注意事项】

1.    尿蛋白检测时，加热尿液的试管口不要对着人，小心加热，切勿让试管内尿液溢出。

2.    血浆尿素氮测定时，各试剂混合后，不超过1～2min，即应放入沸水浴锅中。

 

【思考题】

1.   判断急性中毒性肾功能不全模型复制成功的依据有哪些？

2.   试分析各指标变化的病理生理学机制。

 

【附录】血清尿素氮测定试剂的配制：

1.    二乙酰-肟-氨硫脲液(DAM-TSC)：称取二乙酰-肟600mg，氨硫脲30mg，蒸馏水溶解并加至100ml。

2.    酸混合液：浓磷酸(85%～87%)35ml，浓硫酸80ml，慢慢滴加于800ml水中，冷却后加水至1000ml。

3.    尿素氮标准贮存液(1mg氮/m1)：称取分析纯尿素2.143g，加0.01mol/L硫酸溶解，并加蒸馏水至1000ml，置冰箱内保存。

4.    尿素氮标准应用液(0.005mg氮/m1)：吸取尿素氮标准贮存液0.5ml，加0.01mol/L硫酸至100ml。